RNA原位核酸杂交：运用探针检测细胞和组织内RNA表达

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    一。概述

    1. RNA原位核酸杂交

    RNA原位杂交（RNA Acid in situ）也称为RNA原位杂交组织化学（RNA in situ）或RNA原位杂交（RNA in situ RISH）。该技术是指利用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织中RNA表达的原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构不变的情况下，根据核酸杂交中的碱基配对原理，用标记的已知RNA核苷酸片段与待测细胞或组织中相应的基因片段进行匹配。结合（杂交）后，形成的杂交体发生显色反应，在光学显微镜或电子显微镜下观察细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。

    RNA原位杂交技术不断完善，其应用领域已远远超过DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面，可以进行定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理技术。同时，它展示了分子生物学在分析低丰度和稀有mRNA表达方面的一个重要方向。

    RNA原位杂交与DNA原位杂交的主要区别如下：

    (1)检测目的不同：RNA原位杂交主要检测分析内源基因，包括细胞内固有基因、异常基因和突变基因。正确反映组织、细胞之间的关系、功能和代谢状态，探索疾病的发病机制、观察治疗效果、评估疾病预后等。第二步是检测外源基因，以获得病毒、细菌等病原学诊断类型。 DNA原位杂交主要用于检测外源基因。

    （2）灵敏度高：在检测细胞和组织中的低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交可以获得更好的定位，而DNA原位杂交则难以信任。

    (3)使用不同的探针：RNA原位杂交多使用RNA或寡核苷酸探针，从而避免了使用双链DNA探针进行杂交反应时存在的复性和两条链之间的第二链。两条链的竞争杂交问题。 cRNA-RNA之间形成的杂交体比DNA-DNA和cDNA-RNA杂交体更稳定。杂交反应后，可用RNase洗脱去除未结合的探针，因此特异性更强。

    2. 荧光原位杂交

    荧光原位杂交（原位FISH）是一种新兴的分子细胞遗传学技术。它是20世纪80年代末在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的非放射性原位杂交技术。

    与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高、多重染色能力等特点。因此，它受到生物和药物研究领域的广泛关注。

    3.

    该公司的技术是一种新型的RNA原位杂交技术，结合了传统RNA原位杂交技术和FISH技术的优点。基于正在申请专利的探针组设计和专有的信号放大方法，准确性、灵敏度、重复性等大大提高，可检测单细胞中低拷贝甚至单拷贝的多个靶基因的RNA。检测。整个实验过程与FISH类似，但时间大大缩短。

    这项划时代的技术使基因研究取得了突破性进展。

    （1）这项新技术主要可应用于以下领域：

    ·细胞转录谱分析

    ·体内外RNAi递送和基因敲除

    ·生物标志物研究

    ·报告基因筛选

   

    ·分子病理学

    ·干细胞分化

    ·细胞生物学

    ·神经生物学

    (2)与传统技术相比，该新技术具有以下优点：

    一个。对于细胞样品

    ·悬浮或贴壁培养细胞、血细胞组织（即将推出）

    ·在单细胞水平检测单拷贝RNA

    ·双“ZZ”探头，精度高

    ·同时检测多达4个基因

    ·优良的信噪比

    ·可在载玻片和多孔板上检测

    ·荧光显微镜检测

    ·在没有抗体的情况下，它是免疫细胞化学研究的极好补充。

    b.适用于福尔马林固定、石蜡包埋的样品

    ·FFPE石蜡包埋组织切片

    ·单基因原位检测

    ·检测限可达10拷贝/细胞

   

    ·双“ZZ”探头，精度高

    ·光学显微镜/荧光显微镜

    二。实验过程

   

   

    三。实验结果展示

    1.同时检测Hela细胞中4种不同管家基因的表达：RPLO（绿色）、PPIB HPRT（黄色）、HPRT（浅绿色）、β-actin（红色）

   

    2.多通道原位杂交检测中，可同时检测HeLa（左上）和SKBR3（右上）细胞中的Her-2 mRNA（绿色）和18S rRNA（红色），并通过荧光显微镜观察和记录。对于极其丰富的18S rRNA，它在整个细胞质中呈现弥漫性着色；相比之下，丰度较低的 Her-2 mRNA 显示出与预期 mRNA 表达水平相关的点状图案，每个点对应 Her 的一个副本。 -2 mRNA（如图所示）。在图4中，使用针对Her-2内含子序列的互补探针组作为阴性对照。在所有板中，细胞核（蓝色）均用 DAPI 染色。

   

    3、PMA处理Hela细胞后不同时间段IL-6和IL-8的表达水平。

   

    4、根据组织切片水平检测结果，显色位置即为目的基因的表达区域。几乎没有背景影响，得到的结果非常准确。

   

    四。用户发表的文章（示例）

    ，J.，等人，在病毒细胞中。 J Virol，2010。84(7)：p3654-65。

    、AM 等人，轴突中的 mRNA。 J，2009。29（15）：p4697-707。

    本文摘自《基因》2010年第2期，未经许可不得转载