时间分辨荧光技术（TRF）原理与应用：探索荧光均相性分析的前沿

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    时间解析荧光原理（TRF）技术

    荧光和同质性分析

    从理论上讲，荧光是最敏感的检测方法。由于许多分子间和分子内变化都会改变标记物的荧光发射。因此，它很早就被用作一种均质分析技术的新方法。极化，淬火，时间相关，荧光寿命变化和荧光共振能量转移（FRET）已被广泛用于分子间效应1-5的研究中。

    但是，在这些应用中，某些技术条件受到严重限制，包括低调节幅度，分析环境组件的信号干扰，迅速变化的荧光背景以及蛋白质，分子和聚合物在光的分析环境中的结果。在这些技术中，FRET是一项有趣的技术。假定能量传递速率取决于激发态供体与附近受体分子6之间的距离。

    对于已知的供体受体对，距离R0（传输效率为50％）的宽度为1-7 nm。使用这些特性，可以将FRET用作光学量表来衡量生物大分子之间的关系，这已通过Et Al.14和随后的研究8-10证实。

    对于研究溶液中分子之间的距离和相互作用，只有少数技术是可行的，因此将FRET技术应用于许多生物领域，例如酶活性11，蛋白-DNA相互作用12和细胞表面上的外源聚集。 13. DNA杂交研究吸引了更多的关注，并且越来越成为研究的重点，因为它可以为FRET原理研究，结构研究，寡核苷酸杂交或基因易位14-18提供支持模型。由于FRET过程发生在抗原和抗体的相互作用之后，因此均匀的荧光分析技术已被广泛发展为17-18。最近，已经使用FRET监测受体的寡聚化，这是信号传导途径中的关键步骤。最后，Tsien等人。开发了新的荧光供体/受体指标，用于测量细胞膜表面电位并观察基因转录过程20-21。

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    但是，这些非常有吸引力的工作并不能掩盖Fret技术面前的困难。例如，由于其自​​动荧光，必须校正测得的荧光强度，未结合的发色团极大地抑制了分析的敏感性，并使随后的结果分析变得复杂。如果供体/受体发射光谱被过滤掉，则会导致对受体发出的长寿命荧光信号检测的敏感性降低。因此，CIS开发了HTRF技术，该技术为受体抑制配对相互作用提供了深入和广泛研究的可能性。该技术利用具有洞穴状结构的欧盟元素的螯合物和标记，将XL665作为供体对。 HTRF技术的功能包括发射光的特殊光谱特性以及可以选择的时间分辨监视模式。如图1所示，当荧光受体和供体紧密接触并刺激供体时，将部分能量转移到受体中。所有这些特征结合在一起，使HTRF技术能够克服FRET技术中的各种限制因素。

    时间分辨荧光（时间，TRF）和稀土元素

    生物液和血清中的许多复合物和蛋白质可以自身荧光，因此使用传统发色团的荧光检测灵敏度将大大降低。大多数背景荧光信号存在短时间，因此将长期寿命标记与时间分辨荧光技术（TRF）相结合可以最大程度地减少瞬时荧光干扰。

    由于稀土元素复合物的特殊光物理和光谱特征，它已成为生物学中荧光应用的重点22-25。稀土三价离子的电子云的结构在活动能级下保护一些电子，从而形成其自身独特的发射光谱。因此，根据量子机械定律，电子的迁移将在一定程度上限制，并且这些元素引起的荧光衰减期通常很长（从μSEC到MSEC）。由于它的一对，出于同样的原因，收集效率效率非常低。因此，将稀土元素螯合物设计为吸收有序零件的光吸收装置。通过分子之间的非辐射途径将收集的能量从单价状态转移到三价状态，然后继续从三价状态转换为稀土元素离子的发射水平，最终导致长期寿命的产生荧光。

    如果将稀土复合物视为生物检测中的荧光探针，则必须具有某些特性，例如稳定性，可选的络合位点，荧光的高量子产率以及与生物分子搭配的能力。此外，对荧光淬火的敏感性低是生物流体研究的必要条件。

    实际上，这些条件并非所有已知的稀土隔和物质都无法使用。即使这些分子可以用于均匀分析中，诸如稳定，螯合和主动竞争者等许多限制因素以及敏感性都是需要解决的问题。

    荧光共振能量传递（FRET）过程中的调节

    CIS开发的均匀技术基于欧盟螯合物和受体（第二荧光标记）之间的荧光共振能量转移。受体标记是藻苷，是植物素。它在化学修饰的发色团XL665之间进行了交联，该化合物XL665还显示了独特的光学物理特性，并且能够与EU3螯合物相互匹配：

    1）它具有螯合物发光光的高摩尔吸收；

    2）在XL665发射光的光谱范围内，螯合物对它们的干扰可忽略不计（图3）；

    3）非常高的量子产率（在生物流体中不会淬火70％）。在荧光共振能量转移中，受体的寿命使荧光等于供体的寿命发出荧光。这是因为具有长衰减周期的TBP-EU（供体）会诱导XL665受体的长发射荧光。由于荧光共振能量与供体TBP-eu，激发后产生的荧光长期在XL665发射的波长范围内长期存在，因此可以将短暂的自散射荧光与短期寿命区分开荧光背景。很容易将fret信号与中间区分开。

   

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    3：TPB EU和

    XL665

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    4：在665 nm。

    在，非 -

    在665 nm，其中大多数

    是按时间。

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