单细胞小RNA测序技术进展：2016年至今的四大突破性研究综述

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    目前，单细胞 RNA 和 DNA 的高通量测序是一项相对成熟的技术。单细胞 DNA 测序的实现使得在非常少量甚至单个细胞的 DNA 水平上识别突变成为可能。单细胞转录组技术可以检测单个细胞中 mRNA 的组成，从而更准确地识别细胞类型和状态。

    小RNA是一类广泛存在于生物体中的非编码RNA，参与调控细胞中超过1/3的基因表达，是基因表达调控网络的重要组成部分，但由于其特殊性，小RNA测序技术在单细胞水平的进展非常缓慢。自 2016 年发表第一篇关于单细胞小 RNA 测序的技术文章以来，迄今仅发表了 4 篇文章。本文简要介绍了这四篇文章中使用的小 RNA 文库测序技术。

    1.-小 RNA 的细胞

    总结：

    在本文中，我们提出了一种单细胞小 RNA 测序方法，并将其应用于人类胚胎干细胞和癌细胞。对 tRNA 和小核仁 RNA 片段 （） 的分析揭示了它们作为不同细胞类型和状态的标志物的潜力。

    技术亮点：

    本文的文库制备技术与常规小 RNA 文库制备技术的主要区别在于以下几点：

    1） 具有 5.8 秒序列的寡核苷酸，用于与 5.8 秒 rRNA 结合;

    2） 5' 接头使用 7 碱基 UMI 去除文库制备和测序过程中 PCR 引入的重复

    3） 文库扩增采用两轮 PCR 扩增，每轮 13 个循环;

    4） 无片段排序，便于自动建库。

    其数据库构建流程图如下：

    图 1 |单细胞小 RNA 文库工艺

    技术效果：

    1） 实现了在单细胞水平检测小 RNA 的目的;

    2） 通过 UMI 校正，单碱基失配率从 2.992% 下降到 0，而 2 碱基失配和 3 碱基失配也有所下降。

    2.使用

    总结：

    本文提出了两种用于单细胞小 RNA 测序的单细胞裂解方法。第一种方法基于基于化学的过夜冷冻技术，而第二种方法利用质膜的芯片电解和物理提取，并通过等速电泳分离细胞质 RNA。通过上述两种方法获得的样品通过芯片外小 RNA 文库技术，并使用修饰的接头序列来防止接头二聚体的形成。K562 单细胞小 RNA 测序显示，该方法需要 6 小时的实验作时间，有效读数的比例相对较高，该方法检测到的 miRNA 丰度从 16,000 拷贝/细胞到约 10 拷贝/细胞不等。

    技术亮点：

    1） 采用两种样品制备方法：将单细胞在 -80°C 下在裂解物和电解质膜中冷冻过夜，并通过 Chip on-chip 物理提取，通过等速电泳分离细胞质 RNA;

    2）在文库构建过程中，使用接头构建文库，以避免形成接头二聚体;

    3） 使用建库套件，可在 6 小时内完成建库;

    4） 不要进行片段排序。

    其数据库构建流程图如下：

    图 2 |数据库构建流程图

    技术效果：

    1） 两种样品处理方法对各种小 RNAs 的检测水平与 （2016） 中发表的方法相似;

    2） 第二种方法的数据质量更好，短片段占 58%，而第一种裂解方法占短片段的 28%，（2016） 占短片段的 42%。

    3） 实验过程仅需 6 小时，（2016 年）中的建库方法需 18 小时。

    3.细胞小 RNA 的小序列

    总结：

    Small seq 是一种基于连接的方法，使用分子标签捕获、测序和计算单个哺乳动物细胞中的小 RNA。本文提供了依赖于标准试剂和仪器的详细方案。标准方案捕获一组复杂的小 RNA，包括 （）、tRNA 片段和小核仁 RNA （）;可以通过添加库排序步骤来完成扩充。从收集细胞开始构建文库需要 2-3 天。

    技术亮点：

    从上面的流程图可以看出，该技术的实验原理和程序与 2016 年发表的文章中发表的实验原理和程序是一致的。但是，本文给出了详细的试剂和实验程序，它们更具可作性。同时，还给出了数据分析的具体命令行，大大减轻了数据分析师的流程开发负担。

    4.-细胞 CAS-seq 人中的一类短 PIWI-RNA

    总结：

    为了研究小 RNA 在灵长类卵母细胞中的重要功能，开发了一种单细胞小 RNA 测序方法 CAS-seq，并在人卵母细胞和胚胎中进行了分析。结果发现，一类约 20 nt 的小 RNA 主要在人和猴卵母细胞中表达，而不在小鼠卵母细胞中表达。它们与 HIWI3 （） 特异性相关，并且明显短于通常已知的 PIWI 相互作用 RNA （），称为卵母细胞短 （os-）。值得注意的是，人卵母细胞的 os- 在 3' 端缺乏 2'-O-甲基化，这是一个经典特征。此外，os- 具有很强的 1U/10a 偏倚性，并在最近进化的转座因子 （TE） 的反义链上富集，表明其通过切割沉默 TE 的潜在功能。因此，本研究鉴定了一个具有不同特征的卵母细胞特异性 piRNA 家族，为研究灵长类卵母细胞中的小 RNA 提供了宝贵的资源。

    技术亮点：

    1） 使用生物素化逆转录引物;

    2） 逆转录引物与 T7 启动子连接，用于后续的 IVT 扩增;

    3） 在文库构建过程中使用 Cas9/sg RNA 去除接头二聚体;

    4） 链霉亲和素纯化的文库;

    其数据库构建流程图如下：

    图 4 |数据库构建流程图

    技术效果：

    1） 检测灵敏度高，单细胞初始文库制备的检测效果接近 200 ng RNA 初始文库制备;

    2） 提高了测序数据的基因组比对率;

    3） 能够检测低表达的小 RNA 分子。

    引用

    1. Omid R，Ilgar，小 RNA 细胞，2016,34，–1266

    2. Ruba ， Shore， M. Han， 使用细胞小 RNA 的高效读取，2018，，90,21,12609-12615

    3. - ， Ilgar ， ，细胞小 RNA 的小序列 ， ， 2018 13， –2424

    4. Yang Q， Li R， Lyu Q， -cell CAS-seq 人类中的一类短 PIWI-RNA，， 2019.10.10.1038/-019-11312-8.