时间分辨荧光技术原理、仪器及应用在生物化学与医学领域的全面解析
时间分辨荧光技术具有两种测量方法：时间域和频域。由于时间分辨的结果数据比稳态荧光数据包含更多的信息，因此近年来，时间分辨荧光技术已成为生物化学和生物物理学领域的主要研究工具之一。荧光寿命成像技术可以同时获得有关分子状态和空间分布的信息，并且在生物学和医学领域也越来越广泛使用。以下将从原理，工具和应用的各个方面简要介绍时间分辨的荧光和荧光寿命测量技术。1荧光和荧光寿命的基本原理
吸收光后分子失活的原理和过程可以直观地用数字表示（图1是简化的表示）。简而言之，根据规则，分子中的单元基态电子能水平S0在分子中吸收特定波长的光子，并在单元激发电子能级（通常是S1状态）中的一定振动能级（通常是S1状态）。这个过程约为10-15；在短暂的振动松弛过程（约10-12-10-10）之后，大量电子将在S1状态的最低振动能状态下积聚。该州的电子将有几种释放能源并返回基态S0状态的方法。这些途径，包括振动松弛，被统称为停用过程。如果能量在能量释放过程中释放，则称为辐射失活。如果仅通过碰撞和其他手段释放能量，并且没有释放光子，则称为辐射失活。
荧光发射是常见的辐射失活过程。它通常是指电子从S1到S0状态并同时释放光子的过程。这个过程的时间通常在10-10-10-10-7之间。通过检测荧光发射强度随时间的变化，可以获得系统的荧光寿命信息。
有几种停用无辐射过程的方法：内部转换是指电子在具有相同多个程度的电子能状态之间的电子过渡的过程，时间通常在10-11到10-9s之间。系统之间的跨度是指电子。不同多个程度的能量状态之间的过渡过程，例如从单重S1到三重态T1的过渡，通常在10-10-10-10-8S之间。荧光淬灭是指通过分子和能量转化的激发分子的相互作用，从而释放能量，也称为外部转换。这些无辐射失活过程在确定系统的荧光寿命中起着非常重要的作用。
另外，在电子过渡到T1状态后，它们有可能以光子的形式过渡到S0状态，这称为磷光发射。否则它们将再次返回S1状态，并将光子释放回S0状态，该状态称为延迟荧光。由于空间限制，这两种类型的发光情况将在此处讨论。
2荧光衰减曲线和荧光寿命
在激发光源的照射下，荧光系统在各个方向发出荧光。当光源停止辐照时，荧光不会立即消失，但会逐渐衰减至0。根据上述原理，理想系统的荧光衰减可以严格得出。
假设其浓度为（mol·l-1），则假设所有A分子的环境都处于近似状态，则稀释溶液A（mol·l-1），则溶液中所有A分子的荧光衰变途径是相同的。如果与该过程中涉及的速率常数相比，如果其持续时间可忽略不计，则可以认为其时间宽度为0。这种理想的线性光源称为Δ2脉冲。上面的溶液用Δ2脉冲激发。由于光吸收和振动弛豫的时间很短，因此可以考虑到时间为0时，一定数量的分子通过吸收光子来达到激发态S1。浓度为表达。这些激发态的这些分子将通过辐射（以下是指荧光）或无辐射途径返回基态S0，它们的速率常数分别由KSR和KSNR表示。可以将此过程与主要反应进行比较，激发分子的衰减率可以通过公式（1）表示：
-d dt =（ksr+ksnr）（1）
整合公式（1），您可以在时间t处获得激发态分子的浓度与初始激发态浓度 0：
= 0exp-tτs（2）
公式中的τ称为激发态S1的寿命，由公式（3）表示：
τs= 1ksr+ksnr（3）
荧光强度IF与激发态分子的浓度成正比，并且荧光辐射停用的速率常数：
if（t）= ksr = ksr 0exp-tτs（4）
使用荧光仪器测量时，观察到的荧光强度IF也与仪器的各种参数有关。因此，荧光强度与激发态的寿命之间的关系可以简单地表示为：
i（t）=αexp-tτ（5）等式（5）
它表明，在具有δ2脉冲作为激发光源的单个系统中，荧光强度衰减了单个指数衰减。观察到的荧光寿命τ等于S1状态的寿命τ，这不仅受荧光发射速率的影响，而且还受各种非辐射过程的影响。因此，直接测量的明显荧光寿命也称为自然寿命。
对于复杂的系统，由于每种荧光物质的不同特性或每种荧光物质所在的微观环境，因此整个系统的荧光衰变曲线的两条线是多个指数衰减功能的总结，称为多指数 - 指数衰减：
i（t）= ∑iαiexp-tτi（6）
基于激发光源是理想的线光源Δ2脉冲的情况（图2）获得上述荧光衰减曲线。实际上，任何实际的光源都有一定的宽度，因此在实际应用中，需要进一步纠正上述表达式。如果激发光源的强度表示为时间e（t）的函数，则检测到的信号r（t）可以表示为E（t）和δ2脉冲响应I（t）之间的卷积得分：
r（t）= e（t）ªI（t）=∫T0e（t'）i（tt'）dt'（7）
基于从上述理论推导得出的结论，可以设计具有荧光寿命的检测工具来分析测量结果并进一步获得系统的动态信息。
3测量时间分辨光谱法
3.1原理和方法
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时间分辨频谱是瞬态光谱，它是切断激发光脉冲后，在不同延迟时间与激发光脉冲测量的荧光发射，反映了激发电子的运动过程（IE荧光动力学）。通常，测量荧光衰减光谱，即激发波长λEX和发射波长λEM的固定检测，并记录荧光强度随时间的变化。通常可以使用两种时间分解技术来实现此测量：基于时间域的脉冲方法和基于频率域的相移方法。
脉冲方法使用非常短的脉冲光源，而相移方法使用调制光源，可以提供各种频率的简单谐波。尽管两者获得的信号均在公式（7）中显示，但它们是激发光和Δ2脉冲响应的结果。但是很明显，由于不同的激发光源，两者获得的信号非常不同。通过脉冲方法获得的荧光发射强度首先增加，并在达到峰后逐渐衰减（图2）。当可以忽略激发光的强度时，衰减情况与Δ2脉冲响应的衰减曲线I（t）一致。因此，为了获得真实的Δ2脉冲响应参数，测得的荧光信号需要是反卷积的操作。
相位移位方法的激发光源是正（cosal）字符串函数形状的简单谐波。它仍然是具有I（t）的正（cos）字符串函数，激发光的频率与信号光一致，但是平衡位置和振幅的阶段和变化存在差异。相变的变化由相移φ表示，而平衡位置和振幅的变化由调制因子M表示（M = M/M0，有关详细信息，请参见图2）。由于可以通过将激发光与信号光进行比较，因此可以直接获得这些参数，因此相位移位方法不需要通过反卷积获得所获得的数据的过程。脉冲方法和相移方法在理论上是等效的，但是检测方法和仪器设计存在许多差异。
3.1.1脉冲方法的测量和仪器
在当前检测荧光寿命或荧光衰减的过程中，脉冲方法是最常用的技术，其中单个光子计数方法（TCSPC）是一种更常用的方法。单光子计数方法的基本原理是，在特定时间发射光子的可能性与此时间点的荧光强度成正比。对于每个激发脉冲仅获得一个荧光发射光子，记录光子出现的时间，并记录坐标上的频率。大量积累后，可以构建荧光发射光子的分布概率曲线，即荧光发动曲线。该过程类似于光的衍射，使单个光子可以通过缝隙积累衍射图像。
单光子计数仪器的示意图如图3所示。重要组件之一称为时间振幅转换器（TAC），该转换器（TAC）记录了两个电信号之间的时间间隔的长度。激发光源发出了短脉冲灯，该脉冲光同时转换为电信号，并开始记录TAC。在通过脉冲光激发样品后，发射的光子也会转换为电信号，并将TAC的记录终止。以这种方式，TAC记录的时间间隔信号将以电脉冲的形式传达给多通道分析仪（MCA），并且将在与MCA相对应的时间通道中记录一个点。大量积累后，将形成荧光衰减曲线。计数越多，获得曲线的精度就越高。通常，衰减曲线的峰值计数必须达到约103至104。此时，只需在相同的检测条件下用光散射溶液（常用硅胶悬浮液）替换样品即可。
时间分辨率是荧光寿命测量仪器的重要参数，它决定了该仪器可以测量的最短荧光寿命。在时间分辨的荧光光谱仪中，无论是脉冲方法还是相移法，时间分辨率都由激发光源和检测器确定。在TCSPC方法中，激发光源的选择非常重要，可以使用各种气体闪光，也可以使用脉冲激光器。闪光的成本相对较低。给定的脉冲基本上在纳秒级，脉冲频率不高（104〜105Hz）。因此，数据采集时间很长。在测量过程中可能会发生光强度漂移，从而影响测量。效率和准确性。脉冲激光器可以在皮秒级上产生脉冲，并且脉冲频率可能很高，但其价格也相对昂贵。就检测器而言，通常使用光电倍增管（PMT），并且也可以使用微通道板检测器（MCP），它们具有更快的响应时间且干扰较少。使用脉冲激光器和MCP的仪器理论上可以检测10到20PS的荧光寿命。
除TCSPC方法外，脉冲方法还使用了频闪技术。该方法的激发光源也是一系列的脉冲光，但是通过控制PMT的检测时间范围，只能测量特定时间段内的荧光强度，即，将衰减曲线分为许多。小段进行测量，最后合并。这种测量方法避免使用昂贵的组件，因为数据采集相对较快，不需要高频闪光或激光。但是，其时间分辨率比单光子计数方法差，并且测量荧光强度低的样品更加困难。 TCSPC方法具有高灵敏度，广泛的动力学线性响应范围和清晰的统计参数的优势。但是，由于TAC仅记录激发脉冲后的第一个发射光信号，因此，如果通过一定的激发脉冲产生了两个发射的光子，则只会记录第一个光子，并且以这种方式获得的荧光曲线将被扭曲，从而使很短的时间，当时的信号频率很高，称为“堆栈效应”。因此，有必要控制发射光的脉冲数量要比激发光的脉冲数（比率小于0.01至0.05）小得多，这意味着大量分子被通过。非辐射。在这种情况下，发出脉冲光束。多个光子的概率很小。但这也意味着计数频率非常低，并且需要大量时间来满足准确测量的要求，因此TCSPC方法需要很长时间。此外，测量结果的反卷积过程也很容易引入错误，尤其是对于荧光寿命短的系统，这尤其重要。
3.1.2相移法的测量和仪器
历史上的第一个测量荧光寿命的仪器使用相移法。测量原理是相对直接的，即激发光源给出了正（宇宙）弦信号，检测荧光发射信号及其变化，并执行相关的计算。激发光源可以是带有单色器的激光器或氙气灯，然后将光源的连续光通过光电调节器（通常是盒子）转换为正（宇宙）和弦光。另外，高频激光器发出的脉冲序列可以被视为自我调节的简单谐波信号，因此也可以用作激发光源。与TCSPC方法相比，如果所使用的激发光源与检测器相同，则两种方法的时间分辨率相似。
基于上述原理设计的相移仪器的示意图如图4所示。激发光通过盒子调制并用样品照射。生成的荧光发射信号通过单色仪，最终进入PMT。该盒子由频率发生器驱动，PMT的检测信号也由另一个频率发生器调节。此外，将频率差保持在数十含Hz的位置，以通过杂化方法实现检测。目的。这样，检测信号将转到低频区域，并且检测准确性将比高频区域更准确。
在测量过程中，激发灯与参考PMT同时照射，并将样品信号与参考PMT接收的信号进行比较，以获得相移φF和传输荧光信号的振幅调制速率MF。之后，将样品替换为散射溶液（通常是硅胶悬浮液），并测量了相对于参考PMT的相对于参考PMT的相移φR和振幅调制速率MR。最后，获得样品的绝对相移和调制因子：分别分别为φ=φf-φr，m = mf-mr。通过这种方式，提供了两个参数来计算荧光寿命，并且计算方法由以下两个方程式表示：
5τφ=1Ωtanφ（8）τm=1Ω1m2-11/2（9）
对于仅具有单个荧光寿命的样品，通过两种算法（8）和（9）获得的结果是一致的。如果结果大大不同，则意味着样品是具有多个荧光寿命的复杂系统。目前，有必要在多个激发频率下测量并总结拟合计算的结果。
3.1.3脉冲方法和相移法的比较
首先，这两种方法在原理上是完全等效的，所提供的信息完全相同。可以从数学上证明，通过调制获得的简单谐波信号只是δ2脉冲的转换形式，即，两者获得的结果仅是时域和频域之间的数学变换。从仪器的角度来看，最新一代的仪器使用脉冲激光作为激发光源和微通道板（MCP）PMT作为检测器。尽管两者中的电子设备不同，但仪器的时间分辨率主要受检测器的时间响应的限制，并且在两种技术中，此参数都是相同的。另外，两种仪器中使用的光学设备基本相同。因此，为了实现相同的时间分辨率，测量两种技术使用的工具的成本越来越近。
但是，由于两者分别对应于时域和频域中的测量值，因此测量和数据处理方法存在很大差异，这些方法主要反映在以下方面：（1）脉冲方法是直观的视图。荧光衰减曲线的，而相移方法给出的转换模式不够直观。 （2）单个光子计数脉冲方法具有较高的灵敏度。即使系统的荧光强度非常低，也可以通过延长采集时间来解决。在相移方法中，为了获得准确的相角和振幅值，测得的荧光强度必须足够强，以使其灵敏度低。 （3）在TCSPC方法中，光子随机分布的误差遵循泊松分布，这有助于数据处理和测量结果的判断。在相移方法中，很难估计所测量的相移和振幅调制率的误差。 （4）用于记录荧光时间分辨光谱并测量荧光时间分辨的各向异性光谱，脉冲方法将更加直接和简单。 （5）相移方法的测量结果不需要反卷积。在脉冲方法中，当测得的荧光寿命不够长时间时，通常需要进行反卷积计算。这要求必须准确测量仪器本身的激发信号，否则对于荧光寿命非常短的系统，通过计算获得的结果将与实际情况大不相同。 （6）从数学角度来看，使用相移方法可以更容易地分析荧光寿命。 （7）尽管脉冲方法通常需要很长时间来收集数据，但收集数据所需的时间取决于特定样本。对于具有单个荧光寿命的系统，相移方法更快。如果该系统由许多具有荧光寿命的物种组成，则这两种方法所需的时间将相似。但是，应该强调的是，相移方法快速以一定频率获得荧光寿命信息的能力使其在诸如荧光寿命成像之类的研究领域具有很大的优势。
3.1.4数据处理方法
过程并拟合测量结果数据，以获取有关荧光寿命的信息。拟合数据时，脉冲方法将单个或多个寿命指数衰减曲线作为模型，并且相位移位定律将相移和振幅调制速率的曲线用于不同的检测频率作为模型。两种方法通常都使用非线性最小二乘法来拟合，并获得数据和拟合曲线之间的差异。标准χ2R越接近1，拟合结果越理想。脉冲方法的标准χ2r计算方法为公式
：χ2r=1ν∑ni = 1r（ti）-rc（ti）σ（i）2（10）
R（Ti）和RC（Ti）分别表示在一定时间的测量数据和计算拟合数据。 n是所有数据点的6个数字，ν是自由度，而σ（i）是第i-th数据点。标准偏差。对于TCSPC方法，测量误差遵循泊松分布，σ（i）大约等于 1/2，因此公式（10）可以转换为：
χ2r= 1ν∑Ni = 1（r（ti）-rc（ti））2R（ti）
在相移方法中，比较了实际测量的相移和幅度调制速率与拟合曲线之间的偏差。可以单独或同时分析这两个数量。同时分析的计算公式如下（12），其中每个数据的数学含义与脉冲方法的数学含义相似。
χ2r= 1ν∑Ni =1φ（ωi）-φC（ωi）σφ（ωi）2+∑ni = 1m（ωi）-mc（ωi）-mc（ωi）σm（ωi）2（ωi）2（12）
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除χ2R外，另一个重要的方法是残留重量。如果拟合是理想的，则数据的残留重量应随机分布在0左右。
w（ti）= r（ti）-rc（ti）σ（i）（13）
对于未知样本，您通常可以根据样本情况或现有经验进行拟合计算，前提是它具有N荧光寿命。如果计算出的χ2R与1截然不同，则意味着先前的假设是不合理的，并且可以更改荧光寿命的数量以进行校正。测量和分析系统的荧光寿命时，当系统包含多种荧光物质时，根据样品本身的条件，每种物质的荧光发射光谱可能符合结果的最终解释。
3.2荧光寿命测量的应用
3.2.1如果混合物的重叠和干扰发生，则系统的准确信息可能不会仅依靠通常的荧光发射光谱法获得。使用荧光时间分辨率技术，可以通过荧光寿命的差异来分析系统中荧光物质的组成，从而提供有价值的信息。图5显示了使用TCSPC方法测量混合系统的示例。对于由吲哚，氨基苯甲酸和氨基嘌呤组成的混合系统，如果根据单个寿命拟合，结果的χ2r= 26.5远非1个，并且残留重量不是随机分布的，这清楚地表明这不是。具有单个荧光寿命的系统。当适合两个生命时，情况会大大改善，但这仍然不是理想的。如果使用三个寿命进行拟合，则可以获得相对理想的结果，并且通过拟合获得的每种物质的荧光寿命非常接近每个单个成分的荧光寿命，这表明该方法的可靠性。应该注意的是，即使获得了这种拟合结果，也不能解释系统中只有三个荧光寿命，并且必须根据系统中的其他信息得出结论。这种人为地假定荧光寿命数量的方法是非线性最小二乘拟合的最大缺点。
即使对于相同的荧光团，由于其微环境的微环境不同，荧光寿命也可能差异很大。因此，使用荧光时间分辨率技术，可以确定不同微环境中的相同荧光团。例如，一种蛋白质分子包含两个色氨酸残基，其中一个残基嵌入蛋白质分子中，另一个嵌入在蛋白质分子的表面中。在正常条件下，两者的荧光寿命相同，只能检测到一个荧光寿命。但是，当溶液中有淬火器时，外部色氨酸残基会受到影响，并且荧光寿命将大大降低。虽然内部色氨酸残基受到蛋白质分子的保护，并且不会与淬火器接触，并且不会发生荧光寿命。改变。这检测到两个荧光寿命，可以确定蛋白质分子包含位于不同微环境中的色氨酸残基。图6显示，脉冲方法和相移方法在上述过程检测中具有相同的结果。
3.2.2蛋白质的结构分析。系统中荧光团的荧光寿命用于分析蛋白质或其他大分子的结构，这是时间分辨荧光技术的重要应用领域之一。该方法基于荧光共振能量转移（FRET）的原理：如果有两个荧光团，一个荧光团（供体）的荧光发射光谱与其他荧光团（受体）以及当时以及当时的荧光吸收光谱充分重叠两个荧光团之间的距离足够接近，偶极子方向大致平行，从供体到受体的能量转移会发生，从而导致两个荧光团的荧光特性发生变化。其中，供体的荧光寿命将大大降低。这是因为在荧光衰减的速率常数中，还有另一个荧光共振能传递，即FRET的贡献，如公式（14）所示。
8τS= 1KSR+ksnr+kfret（14）
可以从公式（15）中获得表示公式（14）中代表FRET速率常数的Kfret项。在公式（15）中，A可以视为常数； κ2是一个方向因素，可以从两个荧光团的偶极方向计算出来。 R是两个荧光团之间的距离。
kfret = A·κ2·R-6（15）kfret
随着荧光团之间的距离增加，它迅速下降。通过测量荧光团寿命的变化，可以清楚地理解。通过检测蛋白质分子中色氨酸残基的荧光寿命或衍生化的荧光团，蛋白质结构分析和动力学研究可以进行蛋白质结构变化。
Gray等。 使用氯化物标记细胞色素C，并使用其用亚铁血红素的fret来测量其荧光寿命，从而提供了几种典型的蛋白质构型并提出蛋白质折叠。结构变化的过程。 使用色氨酸的荧光寿命变化来研究开发过程中蛋白质的结构变化。这项工作的数据处理不使用最小二乘方法，而是使用另一种方法来处理获得的荧光寿命数据：最大熵值法（MEM）。该算法不符合几个独立的荧光寿命，而是给出荧光寿命的分布。由于最大的熵方法不需要假定系统中有几个荧光寿命，因此可以获得更具体和准确的荧光寿命信息。
另外，使用极化光源测量荧光衰减曲线，可以获得时间分辨荧光各向异性光谱。通过数据分析，可以获得荧光团在蛋白质中的旋转动力学信息，从而确定荧光团所在的环境的刚度，这有助于判断蛋白质的结构细节。等。 使用时间分辨的荧光各向异性光谱在各种构型下获得蛋白质的更详细的结构信息，并用FRET方法的结论证实了蛋白质。
最近，随着分子力学和计算机分子模拟技术的发展，研究已开始将分子模拟与荧光寿命相结合，并使用模拟蛋白质结构来计算色氨酸的荧光寿命，并将其与实验数据进行比较。理论和实验结果被重新测试。克拉克等。 模拟了四环素抑制剂蛋白复合系统的分子结构，并通过计算分子中色氨酸残基的荧光寿命，并提出了现有理论来解释多索引衰变的实验现象。询问。 This linksrealwith . If thiscan be morein the , it willbring greatto theand at thelevel.
3.2.3 (FLIM)
Time-, or (FLIM), is an for large-scale ofsuch as cells, and.theof antime- with CCD towide-fieldof . Since the isof theof theand is veryto thewhere it is , the of theand the local can be . In , by of the , the and thecan also be known.
can be used for and . If isin, the of thecan be . a Y-typeflow path, and the twoof Y, and then using tothe in the flow path at the node and. 。with three- , the of (such as6G and, 22and) can be( 7) .
Some of thecan also beusing . Since the of in media, they will show .to this , thein cells can be . Theofmedia wasusingtypes of boron- () . Therotor is co- with the cells to enter the cell, and then the of therotor isby (TCSPC).have found that theandtime of such is to the the range ofof 0.028 to 0.950Pa·s, thusthat the of cells is 0.140±0.040Pa·s.
and inandcan emit , soandare a good class of . When bound to, theofand, which willthe ofand. Using this , p53 was used top53 , and therange can reach nmol to pmol , which can bewithELISA.
In terms of cell , canthe of the in the cell. Skala et al. used the of NADH and FAD tothe NADH and FADin cells ( 8), and found thein redox ratio, NADH and FAD cells andcells. 。 Thishas a on theon cell and . With the help ofthat areto pH with , the cells can beas a whole tothe pHin the cell ( 9) , MEF), which can theof 检测。 Using thistothe outerof at 20 nm, metal were. After , the by30 times, and the was and thewas. Suchareto be used in the study of cell .
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